二氢乙锭

二氢乙锭可有效地作为测量活性氧物质的探针。染料自由进入细胞并脱氢成溴化乙锭。该探针已被广泛用于NK细胞，并作为鉴定肿瘤中增殖和缺氧细胞的重要染料。已经使用嗜中性粒细胞和内皮细胞以及HL60细胞和巨噬细胞进行了研究。该探针的主要优点是能够区分超氧化物和H₂O_2,荧光发射发生在约600nm处。

用于染色细胞的样品方案

以下过程提供了一般准则，实际情况应根据您的特定实验进行修改。

1.制备5-10 mM DMSO储备溶液。应将未使用的DMSO储备溶液等分到单次使用的小瓶中并储存在-20℃，避光。

2.在生理缓冲液（如PBS，HBSS，HEPES）中使染料的工作浓度为5-20μM。最佳工作浓度必须根据经验确定。

3.将染料工作溶液（来自步骤2）等体积（例如100μL细胞在生长培养基中）加入细胞中，并在室温或37℃下孵育细胞5至60分钟。

4.在将细胞暴露于实验诱导物之前，确定负载细胞样品的基线荧光强度。

5.阴性对照应评估如下：

5.1检查有没有诱导物的染料和缓冲液/培养基的无细胞混合物的荧光。 在没有细胞外酯酶和其他氧化酶的情况下，荧光随时间的逐渐增加可能会自发水解，导致水解的原因可能与大气氧化或光诱导氧化有关。

5.2检查已经保持在生长培养基或缓冲液中的未处理（对照）负载细胞的荧光。在健康细胞中，氧自由基被细胞酶和天然抗氧化剂消除。 在染料加载结束后，健康细胞应表现出低水平的荧光，在实验期间相对稳定; 可以观察到荧光的逐渐增加（由于自动氧化）或减少（由于细胞中的染料损失或光漂白）。在没有任何刺激或诱导的情况下，健康的未经处理的细胞中的荧光突发可以指示细胞死亡或一些其他氧化事件的进展。

6.可以用叔丁基过氧化氢（TBHP）刺激阳性对照至终浓度~100μM（基于细胞的敏感性和反应增加或减少剂量而定）。