活细胞荧光示踪探针FDA[荧光素二乙酸盐]

FDA（荧光素二乙酸酯）是一种非荧光疏水性荧光素衍生物，可以通过细胞膜（包括哺乳动物和细菌细胞），因此细胞内酯酶水解产生高荧光产物荧光素的二乙酸酯基团。荧光素分子在具有完整膜的细胞中积累，作为细胞活力的标记。不具有完整细胞膜或活性代谢的细胞可能不会积聚荧光产物，因此不会表现出绿色荧光。FDA可以与PI染色组合使用，因为非活细胞摄取PI并将死细胞染成红色，而活细胞不吸收PI并且应该仅染色绿色。与单色分析相比，非活细胞和活细胞的这种双色分离可以提供更准确的细胞活力定量。

 操作步骤 1.准备2-10 mM DMSO储备溶液 将4.2mg溶于1ml DMSO中以制备10mM储备溶液（1mg / ml相当于~2.4mM） 注意：应立即使用原液; 应将任何剩余的溶液等分并在<-20℃冷冻。 避免反复冻融循环，避免光照。 

               2.准备染料工作溶液 在使用之前，通过用Hanks和20mM Hepes缓冲液（HHBS）或您选择的缓冲液（pH7）稀释步骤1中的DMSO储备溶液，准备1至20μM染料工作溶液。通过涡旋混合均匀。   

               3.用流式细胞仪或荧光显微镜分析细胞：

              3.1用测试化合物细胞培养一段所需的时间。

              3.2离心细胞，每管2-10×105个细胞。 

              3.3在500μL染料工作溶液中重悬细胞（来自步骤2）。 

              3.4在室温或37°C下用染料溶液孵育细胞15至30分钟，避光。 

              3.5从细胞中取出染料工作溶液，用HHBS或您选择的缓冲液清洗细胞。 将细胞重悬于500μL预热的HHBS或培养基中，得到每管2-10×105个细胞。

              3.6用流式细胞仪（FL1通道）或荧光显微镜观察Ex / Em = 490 / 520nm处的荧光变化。 注意：对于细菌细胞染色：当通过测试细菌过夜生长预处理的营养肉汤中1：800稀释储备溶液时，染色是最有效的，但也可以使用新鲜营养肉汤或PBS。 

                  细菌悬浮液应用PBS 稀释至每毫升105-107个生物。 可以通过将1ml溶液施加到.45μm过滤器（25mm）并真空过滤除去溶液，然后加入1ml染料溶液并在室温下孵育5-10分钟来染色细菌。